PCR thev naus laus zis yuav tsum muaj cov txheej txheem tsim nyog tsim nyog thiab muab cov qauv DNA tshem tawm, thiab tom qab ntawd ua haujlwm tsis siv neeg thermal cycling, thiab thaum kawg ua cov khoom txheeb xyuas thiab tshuaj xyuas. Tam sim no, primer tsim thiab synthesis tsuas yog ua tau nyob rau hauv ob peb lub koom haum tshawb fawb, cov koom haum, thiab cov chaw kho mob uas muaj zog technical. Daim ntawv thov tsuas yog yuav tsum tau yuav cov khoom siv kuaj xyuas PCR los pib ua haujlwm.Muaj ntau yam cuam tshuam hauv PCR tsis siv neeg thermal voj voog. Rau cov qauv DNA sib txawv, tus nqi ntawm ntau yam khoom ntxiv hauv PCR cov tshuaj tiv thaiv thiab qhov ntsuas kub tsis sib xws.
Ntau yam tseem ceeb cuam tshuam tam sim no tau qhia raws li hauv qab no.
Ib qho, qhov ntsuas kub ntawm lub voj voog
Nyob rau hauv PCR tsis siv neeg thermal voj voog, qhov tseem ceeb tshaj plaws yog qhov kub thiab txias ntawm denaturation thiab annealing. Raws li pom nyob rau hauv kev ua hauj lwm piv txwv, cov kev mob ntawm denaturation, annealing thiab extension yog: 94 ℃ 60s, 37 ℃ 60s, 72 ℃ 120s, tag nrho ntawm 25 ~ 30 A voj voog, lub amplified fragment yog 500bp. Ntawm no, lub sij hawm ntawm txhua kauj ruam yuav tsum tau xam tom qab cov tshuaj tiv thaiv sib tov ncav cuag qhov kub thiab txias. Nyob rau hauv lub tsis siv neeg thermal cycler, lub sij hawm los ntawm qhov qub kub ntawm qhov sib tov mus rau qhov yuav tsum tau kub yuav siv sij hawm 30-60s Qhov ntev ntawm lub lag luam lub sij hawm nyob ntawm ntau yam, xws li hom tshuaj tiv thaiv raj, phab ntsa thickness, ntim ntawm cov tshuaj tiv thaiv sib tov, tshav kub. qhov chaw (dej da dej lossis cua sov thaiv), thiab qhov kub ntawm qhov sib txawv ntawm ob kauj ruam, uas yuav tsum tau muab txaus thaum teeb tsa lub voj voog thermal Ua tib zoo saib thiab txiav txim siab, thiab ntsuas qhov tseeb yuav tsum tau ua ntawm txhua qhov ntsuas.
Lwm qhov kev txiav txim siab tseem ceeb txog lub sij hawm thermal voj voog yog qhov kev ncua deb ntawm ob lub primers; qhov deb tshaj qhov kev ncua deb, ntev nws yuav siv sij hawm los ua ke tag nrho ntev ntawm lub hom phiaj ib ntus. Lub sij hawm cov tshuaj tiv thaiv tau muab los saum toj no yog nyob ntawm qhov pom kev sib xyaw ua ke ntev ntawm 500bp Lub hom phiaj sib lawv liag tau kos. Ntawm no yog ib qho kev qhia txog kev xaiv ntawm ntau yam kub.
1. Template denaturation temperature Lub denaturation kub txiav txim siab qhov kub ntawm ob-stranded DNA melts nyob rau hauv cov tshuaj tiv thaiv PCR. Yog tias qhov kub thiab txias tsis ncav cuag, yuav tsis muaj cov qauv DNA ib leeg, thiab PCR yuav tsis pib. Tsawg denaturation kub txhais tau tias tsis tiav denaturation, DNA ob-stranded Nws yuav renature sai, yog li txo cov yield. Feem ntau 90 ~ 95 ℃. Thaum cov qauv nce mus txog qhov ntsuas kub no, nws yuav tsum tau txias sai sai rau qhov kub ntawm qhov annealing. DNA denaturation tsuas yog siv ob peb feeb xwb, thiab nws tsis tsim nyog rau lub sijhawm ntev; ntawm qhov tsis sib xws, koj yuav tsum sim koj qhov zoo tshaj plaws ntawm qhov kub thiab txias. Txo nws kom tswj tau cov haujlwm ntawm Taq DNA polymerase. Qhov siab tshaj plaws denaturation kub tom qab ntxiv Taq DNA polymerase yuav tsum tsis pub tshaj 95 ° C.
2. Primer annealing kub Lub annealing kub txiav txim qhov tseeb thiab tawm los ntawm PCR; Yog tias qhov kub thiab txias, qhov tshwj xeeb yog qhov muaj zog, tab sis yog tias qhov kub thiab txias siab dhau lawm, cov primer tsis tuaj yeem ruaj khov nrog cov qauv, thiab DNA amplification efficiency txo; Qhov kub thiab txias yog qhov tsawg, qhov tawm los yog siab, tab sis tsawg dhau tuaj yeem ua rau primer thiab template mismatch, tsis yog cov khoom tshwj xeeb nce. Feem ntau, pib nrog cov tshuaj tiv thaiv ntawm 37 ℃, teeb tsa cov tshuaj tiv thaiv kab mob los txiav txim siab qhov ntsuas kub zoo tshaj plaws rau cov tshuaj tiv thaiv tshwj xeeb. Nws kuj tseem tuaj yeem suav tau raws li (G+C)% cov ntsiab lus ntawm cov primers kom nkag siab qhov kev sim Qhov pib ntawm qhov kev sim dav dav, qhov ntsuas kub ntawm Ta (annealing kub) yog 5 ℃ qis dua qhov kub melting TTm (melting kub) ntawm amplification primer, uas yuav raug xam raws li tus qauv:
Ta = Tm-5 ℃ = 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5 ℃
Ntawm lawv, A, T, G, thiab C feem sawv cev rau tus lej ntawm cov hauv paus. Piv txwv li, rau primer ntawm 20 lub hauv paus, yog tias cov ntsiab lus ntawm (G+C)% yog 50%, qhov pib ntawm Ta tuaj yeem teeb tsa ntawm 55 ° C. Ntawm qhov zoo tshaj plaws primer concentration (xws li 0.2μmol / L), cov tshuaj tiv thaiv annealing tuaj yeem ua tiav hauv ob peb vib nas this, thiab lub sijhawm ntev tsis tsim nyog.
3. Qhov kev xaiv ntawm primer extension kub nyob ntawm seb qhov kub thiab txias ntawm Taq DNA polymerase. Feem ntau 70 ~ 75 ℃, tus qauv tus nqi ntawm enzyme catalyzed nucleotides ntawm 72 ℃ tuaj yeem ncav cuag 35 ~ 100 nucleotides / sec. ib feeb. Qhov ntev ntawm 1kb tuaj yeem txuas ntxiv, thiab nws qhov ceev yog nyob ntawm qhov muaj pes tsawg leeg ntawm cov tshuaj tsis haum, tus nqi pH, ntsev concentration thiab qhov xwm txheej ntawm DNA qauv. Yog hais tias lub amplified fragment luv dua 150bp, cov kauj ruam txuas ntxiv tuaj yeem raug tshem tawm, thiab nws dhau los ua ob lub voj voog kub, vim Taq DNA Cov polymerase txaus los ua kom tiav cov synthesis ntawm luv luv sequences ntawm annealing kub. Rau luv luv ntu ntu ntawm 100 thiab 300 bp, nws yog qhov zoo siv lub voj voog ceev thiab yooj yim dual-kub. Thaum lub sij hawm no, lub primer extension kub yog tib yam li lub annealing kub. Rau DNA fragments saum 1kb, lub sij hawm txuas ntxiv tuaj yeem tswj tau li ntawm 1 txog 7 feeb raws li qhov ntev ntawm cov khoom tawg. Nyob rau tib lub sijhawm, gelatin lossis BSA reagent yuav tsum tau ntxiv rau PCR tsis ua kom cov Taq DNA polymerase nquag thiab ruaj khov rau lub sijhawm ntev. Kev sib deev; 15% -20% glycerol pab kom nthuav dav txog 2.5kb lossis ntev dua DNA tawg.
4. Tus naj npawb ntawm cov voj voog ntawm cov pa PCR feem ntau yog 25 mus rau 40 lub voj voog. Qhov yuam kev dav dav yog tias tus lej ntawm lub voj voog ntau dhau, cov keeb kwm tsis tseeb yog qhov hnyav, thiab qhov nyuaj nce ntxiv. Tau kawg, tus naj npawb ntawm cov voj voog ntawm cov tshuaj tiv thaiv tsawg dhau, thiab cov txiaj ntsig tau qis. Yog li ntawd, nws yog ib qho tsim nyog los xyuas kom meej tias cov khoom tau txais. Raws li qhov tsim nyog ntawm tus nqi, tus naj npawb ntawm cov voj voog yuav tsum raug txo kom tsawg.
Tom qab qhov kev nthuav qhia tiav, cov qauv yog txias thiab khaws cia ntawm 4 ° C.
2. Primer Primer Tsim
Yuav kom nthuav dav cov qauv DNA, koj yuav tsum xub tsim ob oligonucleotide primers. Lub npe hu ua primers yog tiag tiag ob oligonucleotide fragments uas yog complementary rau lub hom phiaj DNA ib theem zuj zus mus rau amplified. Qhov kev ncua deb ntawm ob lub primers txiav txim siab qhov ntev ntawm lub amplified fragment. , Lub 5' kawg ntawm ob lub primers txiav txim siab txoj hauj lwm ntawm ob 5' kawg ntawm cov khoom amplified. Nws tuaj yeem pom tias cov primers yog tus yuam sij rau kev txiav txim siab qhov ntev, txoj hauj lwm thiab cov txiaj ntsig ntawm PCR amplified fragments, thiab cov primer tsim tseem ceeb dua.
Cov xwm txheej tsim nyog rau kev tsim primer yog tias lub hom phiaj DNA sib txuas ntxiv rau primer yuav tsum paub. Qhov sib lawv liag ntawm ob primers tsis tas yuav tsum tau meej. Ob lub npe hu ua feem ntau yog 15-20 lub hauv paus, uas tuaj yeem ua ke nrog DNA synthesizer. Ua raws li ob qho kev sib xyaw ua ke, ntxiv rau, cov ntsiab lus feem ntau ua raws hauv kev tsim primer suav nrog:
1. Lub primer ntev yog xam raws li kev txheeb cais, thiab qhov tshwm sim uas ib qho oligonucleotide ib ntus ntawm txog 17 lub hauv paus yuav tshwm sim hauv tib neeg genome yog ib zaug. Yog li, qhov ntev ntawm primer feem ntau tsis tsawg dua 16 nucleotides, thiab qhov siab tshaj plaws Tsis pub tshaj 30 nucleotides, thiab qhov ntev tshaj plaws yog 20-24 nucleotides. Xws li luv luv oligonucleotides yuav tsis tsim ib tug ruaj khov hybrid ntawm lub polymerization kub (dhau 72 ° C). Qee zaum nws tuaj yeem nyob ntawm 5' Ntxiv cov kab ke uas tsis ua tiav rau cov qauv thaum kawg, xws li kev txwv cov chaw enzyme lossis cov neeg txhawb nqa, kom ua tiav cov noob cloning thiab lwm yam kev xav tau tshwj xeeb; cov primer 5' kawg biotin daim ntawv lo lossis daim ntawv fluorescent tuaj yeem siv rau ntau lub hom phiaj xws li kev tshawb nrhiav microbial.
Qee zaum cov primer tsis ua haujlwm' tsis ua haujlwm, qhov laj thawj tsis paub, koj tuaj yeem txav txoj haujlwm los daws nws.
2. Cov muaj pes tsawg leeg ntawm (G+C)% cov ntsiab lus primers yuav tsum zoo ib yam, thiab sim kom tsis txhob muaj tib lub hauv paus polymer. Cov (G+C)% cov ntsiab lus nyob rau hauv ob lub primers yuav tsum zoo ib yam li qhov ua tau, nyob rau hauv lub paub amplified fragment (G+C) % Cov ntsiab lus yuav tsum nyob ze rau lub fragment kom amplified, feem ntau 40% mus rau 60% yog zoo dua.
3. Sab hauv ntawm cov primer yuav tsum zam qhov tsim ntawm pom tseeb cov qauv theem nrab, tshwj xeeb tshaj yog cov qauv hairpin. Piv txwv li:
4. Yuav tsum tsis muaj qhov sib ntxiv ntawm ob lub primers ntawm primers, tshwj xeeb tshaj yog nyob rau ntawm 3' kawg ntawm primer. Txawm hais tias nws tsis tuaj yeem zam tau, 3' qhov kawg ntawm lub hauv paus yuav tsum tsis txhob ntau dua 2 lub hauv paus, txwv tsis pub nws yooj yim los tsim" primer dimer" Los yog" Primer dimer" (Primer dimer). Lub npe hu ua primer dimer yog qhov tseem ceeb ntawm ob-kab DNA tawg tawg ua los ntawm kev txuas ntxiv ntawm ib qho primer ntawm lwm qhov primer raws li kev ua ntawm DNA polymerase. , yog ib qho khoom los ntawm PCR, thiab qee zaum txawm dhau los ua cov khoom tseem ceeb.
Tsis tas li ntawd, zam kev sib txawv ntawm ob lub primers, tshwj xeeb tshaj yog cov oligonucleotide fragments nrog ntau tshaj 6 lub hauv paus sib law liag, txwv tsis pub ob lub primers yuav sib tw nrog ib leeg rau tib qhov chaw ntawm cov qauv; Zoo sib xws, cov primers thiab lub hom phiaj DNA yuav tsum tau amplified Los yog lwm yam sequences ntawm tus qauv DNA tsis tuaj yeem muaj homologous sequences ntawm ntau tshaj 6 lub hauv paus. Txwv tsis pub, cov primers yuav khi rau lwm qhov chaw, txo cov amplification tshwj xeeb thiab ua kom tsis muaj qhov tshwj xeeb amplification.
5. Primer 3' kawg khub DNA polymerase ntxiv ib qho nucleotide rau 3' kawg ntawm cov primer. Yog li ntawd, kev sib koom ua ke ntawm 5-6 lub hauv paus los ntawm 3' kawg ntawm primer thiab lub hom phiaj DNA yuav tsum yog qhov tseeb thiab nruj kom ntseeg tau tias muaj txiaj ntsig PCR amplification. .
Txawm hais tias tus primer tsim tsim nyog tuaj yeem tshawb xyuas los ntawm kev tshawb fawb hauv computer siv PCRDESN software thiab American PRIMER software.
Artificially synthesized oligonucleotides yuav tsum zoo dua yog purified los ntawm chromatography (chromatography) los yog PAGE kom tshem tawm impurities xws li luv luv chains uas tsis tau synthesized mus rau tag nrho ntev. Purified primers khaws cia nyob rau hauv 25% acetonitrile tov ntawm 4 ° C tuaj yeem tiv thaiv kab mob Nyob rau hauv ib txwm muaj, tsis siv primers yuav tsum muab cia rau hauv lub tub yees ntawm -20 ° C. Cov primers tuaj yeem khaws cia hauv cov kua rau 6 lub hlis, thiab tuaj yeem khaws cia rau 1 txog 2 xyoos tom qab lyophilization.