Cell kab lis kev cai yog ib qho tseem ceeb tshaj plaws cov cuab yeej siv nyob rau hauv cell thiab molecular biology, muab ib tug zoo heev qauv system rau kev kawm ib txwm physiology thiab biochemistry (piv txwv li, metabolic kev tshawb fawb, kev laus), cov teebmeem ntawm cov tshuaj thiab cov tshuaj lom nyob rau hauv lub hlwb thiab cov teebmeem. ntawm cell mutagenesis thiab carcinogenesis. Nws kuj yog siv rau hauv kev tshuaj xyuas tshuaj thiab kev tsim kho, thiab hauv kev tsim cov khoom siv roj ntsha loj (xws li tshuaj tiv thaiv, kho cov protein). Ib qho txiaj ntsig tseem ceeb ntawm kev siv cov kab lis kev cai ntawm tes rau ib qho ntawm cov ntawv thov no yog qhov sib xws thiab kev tsim tawm ntawm cov txiaj ntsig uas tuaj yeem tau txais los ntawm kev siv ib pawg ntawm clonal hlwb.
cell kab lis kev cai
Cell kab lis kev cai hais txog kev tshem tawm cov hlwb los ntawm cov tsiaj lossis cov nroj tsuag thiab lawv txoj kev loj hlob nyob rau hauv ib qho chaw zoo nkauj. Cells tuaj yeem raug tshem tawm ncaj qha los ntawm cov ntaub so ntswg thiab dissociated enzymatically los yog mechanically ua ntej kab lis kev cai, los yog lawv tuaj yeem muab tau los ntawm cov kab tsim los yog cov kab mob.
1. Kev cob qhia thawj zaug
Thawj kab lis kev cai yog hais txog theem ntawm kab lis kev cai tom qab cov hlwb tau raug cais tawm ntawm cov ntaub so ntswg thiab nthuav tawm nyob rau hauv cov xwm txheej tsim nyog kom txog rau thaum lawv nyob txhua qhov chaw muaj substrate (piv txwv li, ncav cuag confluence). Nyob rau theem no, cov hlwb yuav tsum tau subcultured (piv txwv li, passaged) los ntawm kev hloov lawv mus rau ib lub thawv tshiab nrog cov tshiab loj hlob nruab nrab kom muaj chaw ntxiv rau kev loj hlob ntxiv.
2. Cov kab ntawm tes
Tom qab thawj subculture, thawj kab lis kev cai hu ua cell kab los yog subclones. Cov kab cell tau muab los ntawm cov kab lis kev cai tseem ceeb muaj lub neej tsis kawg (piv txwv li, lawv raug txwv) thiab thaum lawv dhau mus, cov hlwb uas muaj peev xwm loj hlob ntau tshaj plaws, ua rau muaj qib ntawm genotypic thiab phenotypic uniformity nyob rau hauv cov pej xeem poj niam txiv neej.
3. Cov kab ntawm tes
Ib kab ntawm tes yuav dhau los ua ib hom kab mob ntawm tes yog tias muaj cov neeg nyob hauv cov kab ke ntawm cov kab ke uas nquag xaiv los ntawm kab lis kev cai los ntawm kev cloning lossis lwm txoj hauv kev. Cov kab cell feem ntau tau txais kev hloov caj ces ntxiv tom qab tus niam txiv kab pib.
4. Txwv cov kab ntawm tes thiab cov kab txuas txuas ntxiv
Cov hlwb ib txwm faib tsuas yog tsawg kawg ntawm lub sijhawm ua ntej poob lawv lub peev xwm loj hlob, qhov kev txiav txim ntawm caj ces hu ua senescence; cov kab cell no hu ua finite. Txawm li cas los xij, qee cov kab ntawm tes ua tsis txawj tuag los ntawm cov txheej txheem hu ua kev hloov pauv, uas tuaj yeem tshwm sim tsis tu ncua lossis raug cuam tshuam los yog raug mob. Ib txoj kab finite ntawm tes dhau los ua ib txoj kab txuas txuas ntxiv thaum nws dhau qhov kev hloov pauv thiab tau txais lub peev xwm los faib tsis tu ncua.
Tsis tu ncua kab lis kev cai ntawm tes yog nquag mus rau genetic drift, finite cell kab yog doomed mus rau lub hnub nyoog, tag nrho cov kab lis kev cai ntawm tes yuav raug rau microbial kab mob, thiab cov cuab yeej tsis ua hauj lwm yuav tshwm sim nyob rau hauv txawm lub zoo tshaj plaws-khiav chaw soj nstuam. Txij li cov kab hluav taws xob tsim los yog cov peev txheej muaj txiaj ntsig uas nws hloov pauv tau siv nyiaj ntau thiab siv sijhawm ntev, nws yog qhov tseem ceeb rau kev khaws cia rau lub sijhawm ntev.
Thaum ib tug me me ntawm cov cell seem tau txais los ntawm subculture, lawv yuav tsum tau khov raws li cov noob qoob loo thiab tiv thaiv los ntawm kev siv hauv chav kuaj. Cov khoom lag luam ua haujlwm tuaj yeem npaj thiab rov ua dua los ntawm cov khoom khov khov. Yog hais tias cov noob qoob loo yog depleted, ces lub cryopreserved ua hauj lwm Tshuag yuav siv tau los ua ib qhov chaw rau kev npaj cov noob tshiab, yielding tsawg kawg nkaus kom muaj nuj nqis los ntawm qhov pib khov.
Txoj hauv kev zoo tshaj plaws rau kev khaws cia cov hlwb yog nyob rau hauv cov kua nitrogen, ua tiav qhov nruab nrab, nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm cryoprotectants xws li dimethyl sulfoxide (DMSO) los yog glycerol. Cryoprotectants txo qis qhov khov ntawm qhov nruab nrab thiab tseem txo qis tus nqi ntawm qhov txias, txo qhov kev pheej hmoo ntawm cov dej khov siv lead ua, uas tuaj yeem ua rau cov hlwb puas thiab ua rau cov cell tuag.
DMSO paub tias yuav pab txhawb kev nkag ntawm cov organic molecules rau hauv cov ntaub so ntswg. Thaum tuav cov tshuaj reagents uas muaj dimethyl sulfoxide, cov khoom siv thiab cov kev coj ua uas tsim nyog rau kev phom sij ntawm cov khoom no yuav tsum tau siv. Pov tseg cov reagents raws li cov cai hauv zos.
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Txiav txim seb tus naj npawb ntawm nqe lus, piv txwv li yog tias cov hlwb yav dhau los tau khov thiab lawv tau thawed peb zaug, cov txheej txheem thawing yuav yog qhov thib plaub.
Ntxiv cov xov xwm loj hlob (tseem ceeb tshaj tawm, calf serum, thiab tshuaj tua kab mob) rau T75 flasks sau nrog kab xov tooj, kab lus, thiab hnub tim
Muab lub hwj kab rov tav rau hauv CO incubator ntawm 37 degree thiab 5 feem pua CO rau tsawg kawg 15 min. Qhov no yuav sov li qhov nruab nrab thiab coj mus rau nws li qub pH (7.0-7.6)
Thaw khov vials nrog cov kab xov tooj ntawm tes hauv 37 degree da dej nrog kev ntxhov siab. Txhawm rau txo qhov kev pheej hmoo ntawm kev kis kab mob, khaws lub o-ntiv nplhaib thiab lub hau saum toj ntawm cov dej (2-5 feeb).
Muab lub vial tso rau hauv lub txee kev nyab xeeb (BSL-2). Txhawm rau kom tsis txhob muaj kab mob, so nrog 70 feem pua ethanol ua ntej qhib lub vial.
Hloov cov dej khov ntawm tes ntim rau hauv lub khob T75 uas muaj qhov nruab nrab loj hlob. Sib tov thiab co lub khob maj mam kom sib npaug sib npaug ntawm cov cell hla lub khob.
Incubate lub hwj thaum hmo ntuj hauv CO2 incubator ntawm 37 degree nrog 5 feem pua CO2. Cia cov cell txuas rau hmo ntuj
hloov nruab nrab ntawm kev loj hlob
Muab lub khob rau ib qho ntxiv 2-4 hnub ntawm 37 degree , 5 feem pua CO2 thiab saib xyuas kom txog thaum lub hlwb loj hlob
Thaum cov hlwb ncav cuag kwv yees li 90 feem pua ntawm qhov sib npaug, cov khoom lag luam ntawm tes tuaj yeem nthuav dav siv T150 flask.
